小脳の酵素組織化学―特にプルキンエ細胞のα-グリセロ燐酸脱水酵素と「固定の問題」をめぐつて―

(1) ダイコクネズミ及びヒト,ネコの小脳について,乳酸脱水素酵素(LDH),コハク酸脱水素酵素(SDH),α-グリセロ燐酸脱水素酵素(α-GPDH)活性を組織化学的に検索した. SDH,α-GPDHの検出にあたつてはintermediatorとしてmenadione (MD)を反応液に添加した. 新鮮凍結クリオスタット切片にて,LDHは顆粒層の“gloneruli cerebellosi”に相当して最も強く,分子層ではformazan顆粒はびまん性に形成されて反応は顆粒層よりやや弱くPurkinje細胞(P-細胞)は核を除いて細胞体に強度～中等度の活性を示し,白質には活性はほとんど証明されなかつた. SDHは全体としてLDHの反応態度に似た像を示し,顆粒層に最も強く,ついでP-細胞層,分子層の順で活性が認められ,白質にはほとんど証明されなかつた. α-GPDH反応は,顆粒層,分子層においてはLDH, SDHとほぼ同じであるが,P-細胞層にはformazanの形成がほとんどなく,あたかも顆粒層と分子層の間に空隙がある様な像を示した.白質には活性はほとんど証明されなかつた,これらの所見は,これまでの報告にほぼ一致するものである. (2) 上記酵素活性の検出にあたり,新鮮凍結クリオスタット切片とともに,同一材料について組織塊をまず10%冷フォルマリンで固定した後に作製した凍結切片をあわせて使用した. SDH,α-GPDH, LDHともに反応は全般に減弱されるが,LDHの反応の減弱の度合は他の2者にくらべて少ないようであつた. ここで注目すべきことは,非固定切片のP-細胞層において,α-GPDHの活性がほとんど認められなかつたにもかかわらず固定切片のP-細胞には反応が認められ,しかもformazan形成は他の部よりもむしろ強度であつた点である.この事実は酵素組織化学における方法の選定や結果の判定にあたつては常に慎重な配慮が要求されることを示す現象であるとみなされ,この点に着目し特に固定の問題をめぐつて諸種の条件を実験的に設定してしらべた. (3) フォルマリン固定切片における反応には, i) 固定時間の長さによる著明な差異がみられない. ii) pHの変化による影響が少ない. iii) 特異的抑制剤による影響がみられない. iv) MDの存在が不可欠である. v) SH-基の関与がある. vi) Nitro-BTの組織への吸着性の増強が関連している. ということを認めた. このことからフォルマリン固定切片に見られる反応は,Nitro-BTの組織蛋白との結合性を前提とて,SH-groupとMDとが関与している非酵素的作用の結果であることを推論した. (4) 小脳組織でP-細胞が他の細胞要素と異なり,非固定切片においてα-GPDH活性をほとんど示さないこと,およびフォルマリン固定によりP-細胞に非酵素的なNitro-BT還元が著明にあらわれることは,P-細胞の細胞化学的特異性の一面を示すものであろう.

With the cerebellum of albino rat, human and cat as the material the activities of lactate dehydrogenase (LDH), succinate dehydrogenase (SDH), and α-glycerophosphate dehydro-genase (α-GPDH) were studied histochemically. For the identification of SDH and α-GPDH, menadione (MD) was added to the incubation medium as an intermediator. In the freshly-prepares cryostat sections of the cerebellum, the activities of LDH and SDH, as has already been reported, have been found in the granular layer (glomeruli cerebellosi), molecular layer and Purkinje cells (P-cells), but the activity of α-GPDH has hardly been detected in P-cell layer. In contrast to this findings, when the tissue block was first fixed with cold formalin solution and then frozen sections were prepared, in the course of identification of α-GPDH the formation of Nitro-BT formazans was observed in P-cells. This fact in dicates that a special precaution is required in the selection of methods and the determination of results inthe enzyme histochemistry. From this point of view, the establishment of various experimental conditions optimal for such a study have been tried　with a specal reference to the problem of the fixation. The following results have been fouud with regard to the reaction in the sections fixed with formalin: 1) there is no marked difference due to the length of fixation time: 2) there is little effect due to the change in pH: 3) no specific inhibitory effect can be observed: 4) the presence of MD is prerequisite;　5) SH-group is involved; and 6) the enhancement of incorporation (adsorption; cf: substativity; Pearse) of Nitro-BT to the tissue is associated with the reaction. From these findings I have postulated that the reaction observable in the formalinfixed sections results from non-enzymic reaction in which SH-group and MD are involved, on the assumption that Nitro-BT is bound to the tissue protein. Furthevmore, the findings that P-cells do hardly exhibit the activity of α-GPDH in the non-fixed sections different from other cellular components of cerebellar tissue, as well as the fact that the non-enzymic recuction of Nitro-BT appears markedly in P-cells of the formalin-fixed specimen, seem to reflect one aspect of the cytochemical specificity of the P-cells.